Il progetto si articola in due fasi:
Prima fase:
A. ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSC) DA CAMPIONI DI TESSUTO ADIPOSO UMANO ADULTO PRELEVATI DURANTI INTERVENTI DI CHIRURGIA (PREVIO CONSENSO INFORMATO DEI PAZIENTI)
Grazie alla collaborazione con colleghi chirurghi, sia universitari che non, è possibile disporre di diversi campioni derivanti sia da tessuto adiposo sottocutaneo che viscerale, prelevati durante interventi chirurgici di varia natura. Si deve aver cura di distinguere le due componenti, sottocutanea e viscerale, che hanno funzioni fisiologiche diverse, in quanto il tessuto adiposo sottocutaneo serve soprattutto per rifornire l’organismo umano di substrati metabolici, mentre quello viscerale è destinato essenzialmente all’accumulo di lipidi in eccesso. E' necessario, quindi, valutare se, nella successiva fase di differenziamento osteogenico, la risposta dei due tipi di cellule (pur sempre staminali mesenchimali) sia uguale o differente in un caso rispetto all’altro. Altri fattori da tenere nella giusta considerazione sono l’età dei pazienti e la possibile presenza di patologie dismetaboliche concomitanti, in particolare obesità e diabete. Tuttavia, in una primissima fase, si sta utilizzando tessuto adiposo di soggetti “sani” mentre, a seconda della numerosità dei campioni che arriveranno, si deciderà se sarà possibile operare anche una distinzione fra tessuto derivante da soggetti sani e dismetabolici. Sui due tipi di cellule (da tessuto sottocutaneo e viscerale) viene eseguita un’analisi citofluorimetrica per rilevare la presenza di marcatori di staminalità di marcatori caratteristici per cellule staminali mesenchimali ed eventuali differenze fra i due tipi di popolazioni cellulari in studio.
B. PROLIFERAZIONE E DIFFERENZIAMENTO OSTEOGENICO DELLE MSC DA TESSUTO ADIPOSO UMANO
Seguendo il protocollo già adottato per MSC derivanti dalla polpa e dalla papilla dentali è possibile:
1. Valutare la velocità di isolamento delle MSC da tessuto adiposo rispetto a quella di MSC derivanti da tessuto dentale.
2. Misurare la velocità di proliferazione delle MSC da tessuto adiposo nel tempo (2, 4, 8, 16 giorni), confrontando i dati ottenuti sia fra i due tipi di MSC adipose che con quelli ottenuti in precedenza per MSC da tessuti dentali.
3. Evidenziare la capacità differenziativa in senso osteogenico dei due tipi di MSC adipose sia mediante analisi in PCR real time, per quanto concerne marcatori precoci (Runx2 e fosfatasi alcalina) che con saggi colorimetrici e densitometrici volti a misurare la presenza e l’attività della fosfatasi alcalina nel tempo (3, 7 e 14 giorni) che la presenza di accumuli di calcio extracellulare (Saggio della Alizarin Red S) a 21 e 28 giorni.
Seconda fase:
VALUTAZIONE DELLA CRESCITA DI OSTEOBLASTI DERIVANTI ADIPOCITI UMANI ADULTI IN PRESENZA DI DIFFERENTI NANO-BIOMATERIALI MODIFICATI
E’ necessario in questa fase verificare la modalità migliore per favorire non solo l’attecchimento ed il differenziamento cellulare, ma anche la possibilità di seguire tale differenziamento sia con analisi ultrastrutturale e microscopica che con i saggi riportati al precedente punto 3 della Fase 1. Si utilizzano piccole superfici piane (0.5 cm per lato con uno spessore di max 200-250 μm) di diversi materiali da inserire in opportune piastre multiwell di coltura al fine di creare un rapporto equilibrato fra superficie di supporto, quantità di cellule adese e quantità di mezzo di coltura. Come scaffold di confronto è impiegata una matrice di idrossiapatite de-proteinizzata da bovino o suino, in assenza ed in presenza di sostanze in grado di arricchire le strutture dei biomateriali test. Possibilità di valutare, come e se, la superficie influenza il processo di crescita cellulare usando parametri in grado di caratterizzare la crescita cellulare in base al tempo, alla quantità di cellule presenti sui campioni ed alla qualità delle attività biologiche che le cellule stesse producono a parità di tempo (/ALP, OC, OPN, RUNX2, etc).
Ricercatori coinvolti:
Renata Ciccarelli, Professore Ordinario di Farmacologia, Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche, Università di Chieti
Iolanda D'Alimonte, senior scientist, attualmente borsista, e Angela Lannutti, dottoranda in Scienze Biomediche e Citomorfologiche, nello stesso Dipartimento
Filiberto Mastrangelo, Specializzabdo in Chirurgia Orale, Dipartimento di Scienze Mediche Orali e Biotecnologie, Università di Chieti
Raimondo Quaresima, Professore Associato di Scienza e Tecnica dei Materiali, Dipartimento di Ingegneria Civile, Edile - Architettura, Ambientale, Università dell'Aquila
Prima fase:
A. ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSC) DA CAMPIONI DI TESSUTO ADIPOSO UMANO ADULTO PRELEVATI DURANTI INTERVENTI DI CHIRURGIA (PREVIO CONSENSO INFORMATO DEI PAZIENTI)
Grazie alla collaborazione con colleghi chirurghi, sia universitari che non, è possibile disporre di diversi campioni derivanti sia da tessuto adiposo sottocutaneo che viscerale, prelevati durante interventi chirurgici di varia natura. Si deve aver cura di distinguere le due componenti, sottocutanea e viscerale, che hanno funzioni fisiologiche diverse, in quanto il tessuto adiposo sottocutaneo serve soprattutto per rifornire l’organismo umano di substrati metabolici, mentre quello viscerale è destinato essenzialmente all’accumulo di lipidi in eccesso. E' necessario, quindi, valutare se, nella successiva fase di differenziamento osteogenico, la risposta dei due tipi di cellule (pur sempre staminali mesenchimali) sia uguale o differente in un caso rispetto all’altro. Altri fattori da tenere nella giusta considerazione sono l’età dei pazienti e la possibile presenza di patologie dismetaboliche concomitanti, in particolare obesità e diabete. Tuttavia, in una primissima fase, si sta utilizzando tessuto adiposo di soggetti “sani” mentre, a seconda della numerosità dei campioni che arriveranno, si deciderà se sarà possibile operare anche una distinzione fra tessuto derivante da soggetti sani e dismetabolici. Sui due tipi di cellule (da tessuto sottocutaneo e viscerale) viene eseguita un’analisi citofluorimetrica per rilevare la presenza di marcatori di staminalità di marcatori caratteristici per cellule staminali mesenchimali ed eventuali differenze fra i due tipi di popolazioni cellulari in studio.
B. PROLIFERAZIONE E DIFFERENZIAMENTO OSTEOGENICO DELLE MSC DA TESSUTO ADIPOSO UMANO
Seguendo il protocollo già adottato per MSC derivanti dalla polpa e dalla papilla dentali è possibile:
1. Valutare la velocità di isolamento delle MSC da tessuto adiposo rispetto a quella di MSC derivanti da tessuto dentale.
2. Misurare la velocità di proliferazione delle MSC da tessuto adiposo nel tempo (2, 4, 8, 16 giorni), confrontando i dati ottenuti sia fra i due tipi di MSC adipose che con quelli ottenuti in precedenza per MSC da tessuti dentali.
3. Evidenziare la capacità differenziativa in senso osteogenico dei due tipi di MSC adipose sia mediante analisi in PCR real time, per quanto concerne marcatori precoci (Runx2 e fosfatasi alcalina) che con saggi colorimetrici e densitometrici volti a misurare la presenza e l’attività della fosfatasi alcalina nel tempo (3, 7 e 14 giorni) che la presenza di accumuli di calcio extracellulare (Saggio della Alizarin Red S) a 21 e 28 giorni.
Seconda fase:
VALUTAZIONE DELLA CRESCITA DI OSTEOBLASTI DERIVANTI ADIPOCITI UMANI ADULTI IN PRESENZA DI DIFFERENTI NANO-BIOMATERIALI MODIFICATI
E’ necessario in questa fase verificare la modalità migliore per favorire non solo l’attecchimento ed il differenziamento cellulare, ma anche la possibilità di seguire tale differenziamento sia con analisi ultrastrutturale e microscopica che con i saggi riportati al precedente punto 3 della Fase 1. Si utilizzano piccole superfici piane (0.5 cm per lato con uno spessore di max 200-250 μm) di diversi materiali da inserire in opportune piastre multiwell di coltura al fine di creare un rapporto equilibrato fra superficie di supporto, quantità di cellule adese e quantità di mezzo di coltura. Come scaffold di confronto è impiegata una matrice di idrossiapatite de-proteinizzata da bovino o suino, in assenza ed in presenza di sostanze in grado di arricchire le strutture dei biomateriali test. Possibilità di valutare, come e se, la superficie influenza il processo di crescita cellulare usando parametri in grado di caratterizzare la crescita cellulare in base al tempo, alla quantità di cellule presenti sui campioni ed alla qualità delle attività biologiche che le cellule stesse producono a parità di tempo (/ALP, OC, OPN, RUNX2, etc).
Ricercatori coinvolti:
Renata Ciccarelli, Professore Ordinario di Farmacologia, Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche, Università di Chieti
Iolanda D'Alimonte, senior scientist, attualmente borsista, e Angela Lannutti, dottoranda in Scienze Biomediche e Citomorfologiche, nello stesso Dipartimento
Filiberto Mastrangelo, Specializzabdo in Chirurgia Orale, Dipartimento di Scienze Mediche Orali e Biotecnologie, Università di Chieti
Raimondo Quaresima, Professore Associato di Scienza e Tecnica dei Materiali, Dipartimento di Ingegneria Civile, Edile - Architettura, Ambientale, Università dell'Aquila